Wprowadzanie na rynek nowych produktów kosmetycznych musi być poprzedzone szeregiem badań potwierdzających ich skuteczność. Ponadto pojawiające się na półkach drogerii nowości powinny być całkowicie bezpieczne. Dotychczas przeprowadzanie testów toksykologicznych wiązało się z przynoszącymi cierpienie procedurami z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych, takich jak psy, koty, króliki czy świnki morskie. Liczne protesty organizacji broniących praw zwierząt, a także względy ekonomiczne spowodowały wprowadzenie przez Komisję Europejską siódmej poprawki do dyrektywy o kosmetykach. Mówi ona o całkowitym zakazie wykorzystywania zwierząt w badaniach kosmetyków, nawet gdy nie istnieją metody badań alternatywne do testów in vivo. Poprawka ta zacznie bezwzględnie obowiązywać od 11 marca 2013 roku. W takiej sytuacji istnieje potrzeba opracowania, zwalidowania i rutynowego zastosowania metod badania produktów w oparciu o hodowle komórkowe in vitro.
    W większości przypadków komórki zwierzęce czy ludzkie można w nieograniczony sposób namnażać w warunkach laboratoryjnych, czyniąc je doskonałym materiałem do badań. Uzyskane w testach in vitro wyniki są porównywalne do analogicznych badań z wykorzystaniem zwierząt, przy mniejszych nakładach finansowych i krótszym czasie trwania badań. Poza tym liczne testy oparte o hodowle komórkowe uzyskały już aprobatę i rekomendacje instytucji dopuszczających nowe substancje i produkty na rynek.

Cytotoksyczność
    Badania cytotoksyczności związków chemicznych w hodowlach komórek in vitro powinny być wstępem do następnych, bardziej szczegółowych testów toksykologicznych. Możliwe jest wtedy wczesne wykluczenie danej substancji jako potencjalnie niepożądanego składnika produktu, co oszczędza czas i środki przeznaczone na rozwój preparatu. Stwarza to także możliwość optymalizacji chemicznej struktury w taki sposób, by pozbyć się zaobserwowanego efektu cytotoksycznego przy jednoczesnym zachowaniu pożądanego działania. Typowe testy cytotoksyczności MTS i MTT oparte są na zdolności enzymu zawartego wyłącznie w mitochondriach żywych komórek do przekształcania bezbarwnej soli tetrazolowej do barwnego formazanu, którego poziom można łatwo oznaczyć spektrofotometrycznie. Test LDH z kolei opiera się na pomiarze aktywności enzymu dehydrogenazy mleczanowej, który wycieka do pożywki hodowlanej tylko z komórek uszkodzonych toksycznym działaniem testowanego związku. Aktywność enzymu oznacza się w barwnej reakcji. Test wbudowywania BrdU pozwala odróżnić efekt cytotoksyczny od efektu cytostatycznego testowanej substancji dzięki wykorzystaniu pochodnej tymidyny, która wbudowuje się tylko w DNA komórek aktywnie dzielących się. Poziom wbudowania określić można przy użyciu specyficznych przeciwciał, a to z kolei koreluje z tempem podziałów komórek.

Wprowadzanie na rynek nowych produktów kosmetycznych musi być poprzedzone szeregiem badań potwierdzających ich skuteczność.

Fototoksyczność
    Szereg substancji chemicznych wchodzących w skład leków czy kosmetyków to potencjalni „fotouczulacze”, czyli substancje wywołujące niepożądane podrażnienia
skóry pod wpływem promieni słonecznych. Efekt ten łatwo zbadać w warunkach laboratoryjnych. Zgodnie z zaleceniami OECD do badań tych używana jest linia unieśmiertelnionych mysich fibroblastów (Balb/c 3T3, klon A31), do których dodaje się badany związek, naświetla światłem UV z zakresu UVA lub UVB, a następnie określa śmiertelność komórek w prostym teście opartym o pobieranie przez nie barwnika - czerwieni neutralnej. Z uzyskanych wyników oblicza się parametr PIF (Photo-Irritation-Factor) określający fototoksyczność badanego związku. Gdy PIF mieści się w zakresie 2-5 mówi się o potencjalnych zdolnościach fotouczulających, natomiast wartość PIF>6 charakteryzuje typowe fotouczulacze. Test fototoksyczności z wykorzystaniem komórek Balb/c został walidowany, a jego sprawdzalność wykazano w porównaniu z testami na zwierzętach. W związku z tym od 1996 roku jest on rekomendowany przez OECD.

Podrażnienia skóry
    Stosowanie kosmetyków lub leków przezskórnych może powodować podrażnienia skóry objawiające się jako pieczenie, swędzenie, zaczerwienienie czy łuszczenie. Problemy takie to nic innego jak miejscowa reakcja zapalna komórek wierzchniej warstwy naskórka na składniki zawarte w preparatach. Do badań podrażnienia świetnie nadają się hodowle keratynocytów. Komórki te budują zewnętrzną żywą warstwę skóry, przez co są najbardziej narażone na działanie czynników zewnętrznych. To one również odpowiedzialne są za wywołanie miejscowego stanu zapalnego poprzez produkcję cytokin prozapalnych, takich jak IL-1α, IL-6, IL-8 czy TNFα. Pomiar poziomu cytokin, głównie IL-1α, jest więc dobrym narzędziem do  oszacowania potencjalnego drażniącego działania preparatów aplikowanych na skórę. Stężenie cytokiny oznacza się w pożywce keratynocytów hodowanych w obecności testowanych substancji w immunoenzymatycznym teście ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Wykorzystując taki test zbadać można również potencjalny przeciwzapalny wpływ pojedynczych substancji lub synergistyczny efekt ich kombinacji. Jednym z silnych stymulatorów uwalniania IL-1α przez keratynocyty jest promieniowanie UV z zakresu UVB. Możliwe więc jest także bezpośrednie określenie ochronnego działania substancji chemicznych i ich kombinacji na uszkodzenia skóry spowodowane nadmierną ekspozycją na światło słoneczne.

Testy genotoksyczności
    Substancje chemiczne stosowane w kosmetykach muszą być zbadane pod kątem działania mutagennego czy kancerogennego, które w konsekwencji może prowadzić do rozwoju nowotworów. Rutynowo, zgodnie z zaleceniami instytucji dopuszczających nowe substancje na rynek europejski i amerykański, w celu identyfikacji mutagenów wykorzystuje się test Ames’a. W teście tym hoduje się specjalnie zmodyfikowane szczepy bakterii Salmonella typhimurium. Związki wywołujące mutacje powodują, że bakterie te zaczynają rosnąć w pożywce pozbawionej histydyny, co nie następuje w przypadku szczepu wyjściowego. Choć wykazano wysoką zdolność testu Ames’a do wykrywania mutacji, to jednak komórki bakteryjne ze względu na różnice w budowie i fizjologii mogą dawać wyniki zarówno fałszywie pozytywne, jak i fałszywie negatywne.
    W przypadku pozytywnego wyniku testu Amesa konieczne jest przeprowadzenie testu analogicznego w układzie eukariotycznym. Zalecany wtedy jest test MLA (Mouse Lymphoma Assay). Wykorzystuje on odpowiednio zmodyfikowane komórki mysiej białaczki, które nie są w stanie rosnąć w hodowli do momentu wywołania w ich DNA mutacji. Alternatywnie genotoksyczność można również oceniać w układzie eukariotycznym w teście mikrojąder (Micronucleus Assay). Są to struktury obecne w cytoplazmie komórek, z wyglądu przypominające miniaturowe jądra komórkowe i podobnie jak one wybarwiające się barwnikiem Giemsa. Mikrojądra tworzą się podczas podziału komórkowego z chromosomów, które wcześniej uległy uszkodzeniu. Pojawienie się mikrojąder świadczy więc o klastogennym, czyli powodującym zmiany w strukturze chromosomów działaniu związku, w obecności którego hodowano komórki. Test mikrojąder standardowo wykonuje się na komórkach ssaczych, uzyskanych z jajników chomika chińskiego (CHO-K1).

Test podrażnienia i uszkodzenia rogówki oka
    Składniki kosmetyków mogą także powodować podrażnienia oczu objawiające się zaczerwienieniem, pieczeniem, uczuciem „piasku pod powieką”. We wczesnych etapach prac nad rozwojem preparatu konieczne jest wyeliminowanie tych potencjalnych efektów ubocznych. W latach 40. ubiegłego wieku do badań podrażnienia oka wprowadzono test Draiz’a – szeroko krytykowany ze względu na jego drastyczność, a jednocześnie niepowtarzalność uzyskanych wyników. Nowe unijne rozporządzenia doprowadzą wkrótce do zastąpienia tych niehumanitarnych praktyk przez testy in vitro. W przypadku testowania podrażnień oka szczególnie przydatne okazały się hodowle komórkowe rogówki. Wielowarstwowe hodowle składające się z komórek śródbłonka, keratynocytów i nabłonka świetnie oddają morfologicznie i fizjologicznie typową rogówkę. W obecności substancji drażniących dochodzi do indukcji stanu zapalnego manifestującego się produkcją m.in. IL-1α. Poziom IL-1α można łatwo oznaczyć w teście ELISA. Dodatkowo, model rogówki przebadać można histologicznie, wykonując standardowe barwienia na skrawkach mikroskopowych. To pozwala na ocenę, która z warstw ulega uszkodzeniu. Jako dopełnienie wykonuje się test cytotoksyczności MTS określający poziom śmierci komórkowej w testowanym modelu.

* * *

    Testy in vitro z konieczności muszą zastąpić stosowane dotychczas badania toksykologiczne z użyciem zwierząt. To dobre rozwiązanie, biorąc pod uwagę przede wszystkim względy humanitarne oraz ekonomiczne. Zastosowanie modeli komórkowych posiada wiele zalet. Można tu wymienić szybkość i łatwość badania procesów komórkowych przy niewielkich kosztach, powtarzalność uzyskanych wyników, możliwość stosowania niewielkich ilości badanych substancji czy możliwość pracy na liniach komórek ludzkich.

 Autor: dr Adrian Zarębski, Selvita S.A.

Artykuł został opublikowany w magazynie "Przemysł Kosmetyczny" nr 1/2012